PCR-RFLP方法鉴定ABO血型基因型

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ABO血型系统是人类最早发现的一种血型分类系统,在临床上具有重要意义。ABO基因中几个碱基的替换、单碱基缺失导致A、B、O三种等位基因的产生,可使红细胞膜表面带有不同抗原,进而形成四种血型表型。

    在汉斯出版社《生物医学》期刊中,有论文研究根据三种等位基因关键位点的不同,采用PCR-RFLP方法扩增DNA片段并进行特异性酶切,根据酶切结果可以初步判断基因型,再通过测序的方法验证酶切结果。该实验对笔者和另一名同学进行了ABO基因型鉴定,结果显示,PCR-RFLP结果与测序结果相一致。

    ABO血型系统是一套应用最广泛的血型分类系统,在临床输血、器官移植、法医检验鉴定等领域都有重要意义。血型的鉴定可通过抗原–抗体反应鉴定红细胞膜表面抗原种类,但这种方法只能区分不同表型,对A型血和B型血的个体不能确定是纯合子还是杂合子。A、B、O等位基因的关键差异在于几个位点的单碱基缺失或替换,因此,如果想鉴定个体基因型,可以对包含相关位点的片段进行测序;可以采用PCR-RFLP方法,选择能够识别相关位点的限制性内切酶,通过是否被酶切判断相关位点的序列情况;也可采用AS-PCR方法,根据相关位点的序列变化设计引物,通过扩增结果条带的有无、长度、数量来判断基因型。

    该实验选择了PCR-RFLP方法。实验中根据参考文献、试剂使用说明等设计实验步骤,进行实验,根据实验结果修改步骤,以得到更好的实验数据。比如在PCR时,第一次PCR每种引物都加入2μL,结果有引物二聚体生成,第二次PCR就将每种引物用量改为1μL,得到的结果就没有引物二聚体。

    酶切反应时第一次使用50μL反应体系,37℃反应30min,电泳结果条带非常浅,不确定是否发生了酶切,推测可能是DNA含量太少的原因;第二次仍使用50μL反应体系,增加反应体系中的DNA含量,延长反应时间为1h,电泳结果条带依然很浅,有很模糊的酶切后的短条带形成,推测体系中DNA浓度仍然太低导致条带很浅,DNA含量太低或酶切不充分导致酶切后的短条带非常模糊;第三次为留出足够的PCR产物用于测序,改用20μL反应体系,加入6μLPCR产物,使体系中DNA浓度比之前更高,同时延长酶切反应时间至3h,得到清晰结果。

    通过该次实验,学生们对ABO血型系统有更深入的了解,同时,锻炼了查阅文献、设计修改实验方案的能力。该次实验是在遗传学实验《人的ABO血型测定》之后提出的自主性实验,希望学生们能够设计实验并检测自己血型所对应的基因型,是遗传学实验教学的有益尝试,达到了提高学生自主设计实验的目的,为以后的毕业设计打下坚实的基础。
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